پس از وقایع بازی اول، دزموند مایلز (نولان نورث) توسط قاتل مخفی لوسی استیلمن (کریستن بل) از Abstergo نجات می‌یابد و به یک خانه امن منتقل می‌شود، جایی که او با تیم او متشکل از مورخ و تحلیلگر شان هستینگز (دنی والاس) ملاقات می‌کند. و تکنسین ربکا کرین (الیزا اشنایدر). آنها Animus خود را ساخته اند که قصد دارند از آن برای آموزش دزموند به عنوان یک قاتل از طریق "اثر خونریزی" استفاده کنند، که به کاربر اجازه می دهد تا مهارت های اجداد خود را با سرعتی سریع بیاموزد. به دزموند دستور داده می شود تا خاطرات اتزیو آدیتوره دا فیرنز (راجر کریگ اسمیت) را که در یک خانواده ثروتمند فلورانسی در سال 1459 در دوران رنسانس ایتالیا به دنیا آمد، زنده کند.

تا سال 1476، اتزیو به یک مرد جوان کاریزماتیک اما بی پروا تبدیل شد. پس از اینکه پدرش جیووانی (رومانو اورزاری) و برادران فدریکو (الیاس توفکسیس) و پتروچیو به جرم خیانت متهم می شوند و توسط قاضی فاسد اوبرتو آلبرتی (میشل پرون) اعدام می شوند، اتزیو تجهیزات Assassin پدرش را پس می گیرد و اوبرتو را برای انتقام به قتل می رساند. اتزیو و خانواده باقیمانده اش - مادرش ماریا (الن دیوید) و خواهر کلودیا (آنجلا گالوپو) - از فلورانس فرار می کنند و به خانه اجدادی خود در مونتریجیونی می روند. در آنجا، عموی اتزیو، ماریو (فرد تاتاسیوره) نقش خانواده آنها را به عنوان اعضای اخوان قاتل توضیح می دهد و اتزیو را برای تبدیل شدن به یک قاتل آموزش می دهد.